Bài giảng ADB tái tổ hợp

Chương IV ADN TÁI TỔ HỢPntpha@ctu.edu.vnPlant genetic biotechnology labBản chất Enzyme cắt giới hạnVectorKể tên vectorBản chất enzyme nốiADN Tái tổ hợp????Giới thiệuKỹ thuật ADN tái tổ hợp (DNA recombinant), là kỹ thuật cho phép tạo ra phân tử ADN chứa nhiều trình tự ADN khác nhau của nhiều sinh vật khác nhau.Kỹ thuật ADN tái tổ hợp được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như sản xuất protein, xây dựng thư viện gen, chuyển genHệ thống enzyme sử dụng trong kỹ thuật ADN tái tổ hợpEnzyme cắt giới hạn1950 : Luria Bertani : thực khuẩn Lamda không xâm nhiễm được một số chủng E. Coli.1965 : Werner Arber (Nobel 1978) chứng minh rằng ADN của thực khuẩn bị phân huỷ : ông đưa ra giả thuyết là do hoạt tính của một enzym từ VK tiết ra enzym này được đặt tên là enzym giới hạn.1970 : Hamilton Smith và Daniel Nathans (Nobel 1978) tinh sạch từ VK Haemophilus influenzae một enzym endonuclease có khả năng cắt AND ngoại (virus SV40) ở vị trí chuyên biệt : enzym cắt giới hạn đầu tiên được khám pháTên gọi của enzym giới hạnChữ đầu viết hoa là chữ đầu tên VK từ đó RE được tríchHai chữ kế ko viết hoa tương đương với tên loài của VKKế đến là chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (cùng một VK)Đôi khi còn có thêm chữ viết hoa để chỉ chủng VK sdVD : Escherichia	 coli 	Ry13	giống 	loài	chủngEcoRI: enzym đầu tiên tìm thấyEcoRV: enzym thứ 5 tìm thấyCác loại enzym giới hạnLoại I: Khi enzym nhận biết trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử AND cách đó 1000-5000 nu và giải phóng độ vài chục nuLoại II: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay vị trí đóLoại III: enzym nhận biết trình tự và cắt AND ở vị trí cách đó 20 nuRE loại II Cắt mạch đôi AND ở những vị trí nhất địnhNhận biết một trình tự đặc trưng gồm vài bp(4-10 thông dụng nhất là 6bp). Trình tự càng dài, các đoạn AND cắt càng lớnKhi cắt có thể tạo đầu bằng hoặc đầu so leVD:EcoRI cắt ở vị trí G AATTC (đầu so le)	 	 CTTAA GEcoRV cắt ở vị trí GAT ATC (đầu bằng)	 CTA TAGMột số dạng khác của RERE Mbo và Sau3AI cùng nhận biết trình tự (isoschizomers)	5’GATC3’	3’CTAG5’RE nhận biết trình tự không đặc hiệuVí dụ NspI GGGCCC có thể thay thế A, TRE BglI GCCNNNNGGCVị trí N có thể thay bất kỳ loại nào trong 4 loại nuMột số quy tắc khi thực hiện phản ứng cắt bằng RENồng độ NaCl của dd đệm, nếu phải sd nhiều RE có nồng độ NaCl của dd đệm khác nhau thì nên cắt với RE có nồng độ NaCl thấp trước rồi đến RE cần NaCl nồng độ cao hơnRE được bảo quản trong dd đệm có 50% glycerol ở -200C, nên thêm vào phản ứng sau cùng, thời gian để bên ngoài càng ngắn càng tốtThể tích pư càng nhỏ càng có hiệu quả vì RE và DNA tiếp xúc với nhau càng tốt tuy nhiên phải bảo đảm thể tích RE ko quá 1/10 thể tích pư vì glycerol nhiều sẽ gây ức chế hoạt động của RECác lọai dung dịch đệm cho phản ứng cắt bằng REMột số RE cần buffer đặc trưng như trường hợp enzyme SmaI phải sử dụng hỗn hợp buffer đặc biệt bao gồm: 20 mM KCl, 10 mM Tris.Cl (pH 8), 10 mM, MgCl2, và 1 mM dithiothreitol. Ứng dụngCắt bộ gen khổng lồ của eucaryoteTạo thư viện genLập bản đồ giới hạnSử dụng trong kỹ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism) phân tích đa dạng di truyền của sinh vậtChuyển gen từ sinh vật này sang sinh vật khác Enzyme nối - lygaseTrong tự nhiên enzymes ADN ligase sửa chữa sự đứt đoạn trên một sợi đơn ADN (nick) hoặc nối các đoạn okasaki của sợi sao chép chậm (lagging strand). Phản ứng nối đoạn (ligation) chỉ có thể được thực hiện khi ở sợi bị đứt đoạn đầu 3’có nhóm OH tự do và đầu 5’ có gốc phosphate Khi cắt phân tử ADN bằng các RE 5’ ACGG	 TAATCGCCA 3’3’TGCCATTA	+	 GCGGT 5’E.Coli ADN ligaseACGGTAATCGCCA TGCCATTAGCGGT T4 ligasePhản ứng nối đoạn của enzyme T4 ADN ligase Enzyme phổ biến trong kỹ thuật tạo dòngCần cơ chất ATP làm cơ chất trung gianEnzyme alkaline phosphate Có thể cắt bỏ gốc phosphat ở đầu 5’ trong mt kiềm (có nguồn gốc từ ruột non bò – CIP- calf intestinal phosphatase)Vector không tự tái tạo vòngChỉ AND ngoại lai không bị cắt gốc phosphat mới có thể nối với vectorEnzyme alkaline phosphate Hệ thống vector sử dụng trong ADN tái tổ hợpKhái niệm vector	Vector là một ADN thường có dạng vòng có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ (E.coli hoặc nấm men) và mượn bộ máy của tế bào chủ để tạo ra nhiều bản sao giống hệt vector ban đầu.Phương pháp phân lập ADN plasmid	Bước 1Sau khi thu hồi và làm sạch các tế bào có chứa plasmid, người ta xử lý trong hỗn hợp SDS, EDTA hoặc NaOH làm ADN sợi đôi biến tính thành ADN sợi đơn nằm cạnh nhau.	Bước 2Xử lý hỗn hợp trên trong môi trường đệm (NaCH3COO+CH3COOH) để kết tủa protein và SDS dạng tập hợp.	Bước 3Đưa về môi trường trung tính, ADN sợi đơn được hồi tính trở lại. Còn ADN (NST) do dài nên hồi tính chậm và kết tủa cùng SDS. Tách ADN plasmid bằng cách kết tủa trong ethanol hoặc izopropanol, sau đó ly tâm tách được plasmid tinh sạch. Các đặc tính của một vector Có khả năng sao chép tích cực, độc lập bên trong tế bào chủDễ xâm nhậpvào tế bào chủCó khả năng tiếp nhận DNA lạCó những đặc tính giúp dễ phát hiện tế bào có chứa chúng (được mã hoá bởi các gen chọn lọc)Tồn tại lâu dài nhưng ít làm xáo trộn tế bào chủCó vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym cắt giới hạn, các vị trí này thường đặt vào giữa các gen chọn lọc (điều này làm cho khi có một đoạn DNA lạ gắn vào vị trí cắt thì cũng gắn vào giữa gen chọn lọc làm bất hoạt gen ấy)Kích thước càng nhỏ càng ưu thế vì sẽ thu nhận được một lượng DNA ngọai lai tối đaMột vector càng có nhiều đặt tính nêu trên càng tỏ ra ưu thế, hiện nay có nhiều loại vector: plasmid, phage, cosmid, YAC, BAC,Tuỳ theo kích thước đoạn DNA và mục đích tạo dòng mà lựa chọn vector phù hợp.Các nhóm vector	Nhóm 1: plasmid	Nhóm 2: Phage/phagemid	Nhóm 3: Nhiễm sắc thể nhân tạo 	(artificial chromosome: BAC và YAC)Nhóm plasmid Là thông tin di truyền (ADN) nằm ngoài nhân,Có khả năng sao chép độc lậpKích thước nhỏ (2-5kb), chứa ít gen chọn lọc. Nhận 8-9kb ADN ngoại lai. Có thể mang một số gen của vi khuẩn và các gen này có thể biểu hiện thành protein. Một số kiểu hình khác nhau của plasmidKháng các chất kháng sinhKháng kim loại nặngSản xuất các chất kháng sinhThuỷ phân các hợp chất hữu cơ phức tạpSản xuất độc tố đường ruột enterotoxinSản xuất chất diệt khuẩn bacteriocinSản xuất các colicin 1Sản xuất haemolysin 2Sản xuất các enzyme sửa đổi 3 và enzyme hạn chế Sự phát triển của các thế hệ vector plasmid Plasmid thế hệ thứ nhất Plasmid tìm thấy trong tự nhiên như CoIE1 Plasmid thế hệ thứ hai Phức tạp hơn, mang nhiều đặc điểm thuận lợi trong việc tạo dòng. Plasmid vector pBR 322 Plasmid thế hệ thứ ba 	Các plasmid mạnh nhất hiện nay1) kích thước nhỏ nên sao chép rất nhanh trong tế bào vi khuẩn tạo một lượng bản sao lớn. 2) Có mang nhiều trình tự nhận biết của các RE xếp nối tiếp nhau gọi là polylinker (vùng đa nối) hay multiple cloning sites (các vị trí tạo dòng). Nhóm các plasmid pUC Nhóm các plasmid pGEM Nhóm các plasmid pBluescript Plasmid vector pUC19 ạo dòng trong plasmid Khử hoạt tính bằng chèn đoạn (insertional inactivation)Cơ chế tác dụng của - galactosidase Tạo dòng theo phương thức khử hoạt tính bằng đoạn chèn isopropyl-thiogalctoside (IPTG) Cơ chất nhiễm sắc thể X-gal Tạo dòng định hướng dùng hai enzymes cắt (directional cloning) Tạo dòng định hướng gen kháng tetracycline (Ter), và gen kháng tetracycline bị khuyến đoạn và mất hoạt tính (Tets)Tạo dòng định hướng dùng enzyme alkaline phosphatase Cắt bỏ gốc phosphate ở đầu 5’của vector thì vector không thể tự nối được với nhau Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vật chủ (tế bào vi khuẩn) Điện biến nạpHóa biến nạp Điện biến nạp (electroporation transformation)óa biến nạp (chemical transformation)ột số vector tạo dòng khácCác bacteriophage  vector Chu trình sinh sản của phage lamda 	Thực khuẩn lambda là một loại virus có khả năng xâm nhiễm và phân giải vi khuẩn. Ưu điểmHiệu quả xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn cao (khoảng 1000 lần so với plasmid)Khả năng sinh sôi rất nhanhKích thước đoạn DNA mục tiêu có thể tiếp nhận lớn (10-25kb)Khuyết điểm Thao tác phức tạpNguyên tắc Chu trình tiềm tan Chu trình tanCắt bỏ gen mã hóa quá trình tiềm tanGắn polylinkerKhông cần gen chọn locMột đặt tính của phage lambda là chỉ những phân tử DNA có kích thước từ 35kb đến 55kb mới có thể chui vào vỏ thực khuẩn thể, nhờ đặt tính này mà khi sử dụng phage lambda không cần dùng gen chọn lọcCác cosmid Cấu tạo cosmid CosmidLà vector nhân tạo, cosmid là một plasmid mang trình tự cos của thực khuẩn lambda (trình tự cos là trình tự điều khiển sự “đóng gói” DNA tái tổ hợp vào phần đầu của phage)Giống như phage sau khi được đóng gói, khả năng xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn cũng rất caoTrong tế bào vi khuẩn nhờ đặc tính của plasmid, các phage cosmid sẽ không phá vỡ tế bào do đó trong trường hợp này chúng ta cũng sẽ thu được những khuẩn lạc trên bề mặt đĩa petriƯu điểm khi sử dụng cosmid vector là có thể tiếp nhận được những đoạn DNA có kích thước lớn từ 35-45kb. Các bước tạo dòng trong cosmid tương tự trong phage lambda.Các vector chuyển gen M13 Các vector tạo dòng và biểu hiện gene trong tế bào chân hạch (Eukaryote) Các vector tạo dòng trong tế bào nấm men Các vector tạo dòng trong tế bào động vật hữu nhũ (mammalian cells)Các nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men YAC (Yeart Artificial Chromosomes), vi khuẩn BAC (bacterial artificial chromosome)Các nhiễm sắc thể nhân tạo của động vật có vú MAC (Mammalian Artificiel Chromosomes) Sự biểu hiện gen Vector biểu hiện 	- Các trình tự mã hóa gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker) để đảm bảo duy trì vector trong tế bào. 	- Một promoter kiểm soát phiên mã (ví dụ: lac, trp hoặc tac) cho phép sản xuất một lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng. 	- Các trình tự kiểm soát dịch mã như vùng liên kết ribosome được bố trí thích hợp và codon khởi đầu ATG. 	- Một polylinker để đưa gen ngoại lai vào trong một hướng chính xác với promoter. Vector biểu hiện ở prokaryotewww.invitrogen.com/site/us/en/ho...880.html Xác định mức độ biểu hiện của gen được tạo dòng Điện di polyacrylamide gel để xác định protein Phân tích Western blot ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)